Pour décrire cette technique, une explication des principes de la chromatographie en phase gazeuse sera d’abord exposée et sera suivie par celle de la spectrométrie de masse et, enfin, il sera exposé comment les deux techniques sont combinées.
La chromatographie est utilisée pour séparer les analytes d’un mélange en fonction de leur affinité pour la matière constituant la phase stationnaire de la colonne. Ces affinités sont basées sur des caractéristiques chimiques et physiques telles que le poids moléculaire, les groupes fonctionnels et la forme moléculaire, mais aucune réaction chimique ne se produit au cours de ce processus. Cette séparation est déterminée par la façon dont les molécules interagissent avec deux phases différentes (une stationnaire et une mobile) dans le système chromatographique. La phase mobile est un solvant qui emmène l’échantillon à travers le système. Les composés d’un mélange sont séparés selon leur affinité pour la phase stationnaire. Il est important que les composants soient solubles dans la phase mobile, car c’est l’entraînement dans la phase mobile qui provoque la séparation.
La chromatographie en phase gazeuse utilise un gaz vecteur, généralement de l’hydrogène ou de l’hélium et une colonne capillaire recouverte d’une couche mince à l’intérieur servant de phase stationnaire. En raison de cette phase stationnaire mince, seules de petites quantités d’échantillons peuvent être analysées. En outre, les échantillons doivent être assez volatiles pour être transportés par le gaz. Afin d’assurer la volatilité et l’interaction avec la phase stationnaire, il est souvent nécessaire de remplacer ou de modifier chimiquement la molécule analyte. On modifie par exemple sa polarité par dérivatisation. Le protocole utilisé pour cette étude est décrit dans le paragraphe suivant. Cette réaction chimique augmente la volatilité des échantillons et ils peuvent être analysés.
Un chromatographe en phase gazeuse est constitué d’une source de gaz, d’un injecteur, d’une colonne dans un four et d’un détecteur. Pour injecter un échantillon, il faut d’abord le dissoudre dans une petite quantité de solvant volatil, généralement l’hexane ou le cyclohexane, et environ 1 microlitre est injecté avec une seringue spéciale. L’échantillon est injecté directement dans la colonne (« on-column ») ou dans un injecteur qui envoie soit tout l’échantillon dans la colonne (« splitless »), soit une partie seulement qu’il est possible de commander (« split »).
La colonne capillaire est longue (15m à 60m), son diamètre intérieur étroit (0,2 à 2 mm), et le tube est creux. Le gaz vecteur passe par le centre de la colonne et la phase stationnaire recouvre la surface intérieure. Les colonnes sont préparées avec des polarités différentes pour la phase stationnaire, des longueurs, des diamètres et des épaisseurs de la phase stationnaire différentes. Ces éléments déterminent la résolution chromatographique, les quantités et les types d’échantillons qu’il est possible de séparer ainsi que le temps d’analyse.
La colonne est dans un four qui sert à faire monter la température lors de l’analyse. Cette hausse permet la séparation chromatographique en augmentant la volatilité des molécules.
Après la séparation dans la colonne, les composants de l’échantillon sont identifiés par un détecteur. Le plus commun est le détecteur à ionisation de flamme (FID). Il est placé à la fin de la colonne et quand arrive un échantillon, il est brûlé dans un mélange d’hydrogène et d’air. S’il n’y a que le gaz (phase mobile), seulement quelques ions sont produits par la combustion ; mais s’il y a une composante organique, un plus grand nombre d’ions est produit. Ces ions produisent un courant qui est proportionnel à la quantité d’échantillon. Ce courant est représenté en fonction du temps pour produire un chromatogramme. Chaque pic correspond à un composant du mélange. Il est possible de quantifier les composants en ajoutant un élément de référence (un standard interne). Par comparaison, il est possible de quantifier une espèce dans l’échantillon. Le temps de rétention d’un composé restera toujours le même du moment que les conditions chromatographiques restent inchangées donc le temps de rétention peut souvent être utilisé pour l’identification. Cependant la prudence est nécessaire car des composés différents peuvent avoir le même temps de rétention. Pour étudier plus précisément l’identité des pics, l’ajout d’un spectromètre de masse comme détecteur peut fournir des informations supplémentaires comme le poids moléculaire pour chaque pic.
Un spectromètre de masse est utilisé pour compter les ions individuellement, étant ainsi un système de détection très sensible. Cette technique est basée sur le principe que la trajectoire des ions ou des molécules chargés électriquement, se déplaçant dans un champ électrique et/ou un champ magnétique imposé, est relative à leurs masses atomiques ou plus exactement, au quotient de la masse sur la charge (m/z). Cela peut être utilisé pour séparer des particules chargées mais de masses différentes. Mais pour cela, un vide poussé est nécessaire pour éviter que les ions soient absorbés ou déviés par leur passage à travers l’air.
Un spectromètre de masse est constitué d’une source de particules chargées, d’un champ magnétique et/ou d’un système de déflexion électrostatique pour la séparation des ions et d’un collecteur d’ions afin de compter les ions.
Les deux sources de gaz les plus communes sont celle à impact électronique (EI), utilisée pour notre étude, et celle à ionisation chimique (CI). Pour la source à impact électronique, l’échantillon, sous forme de gaz, entre dans une chambre sous vide et est traversé par un faisceau d’électrons, généré à partir d’un filament de tungstène chauffé et accéléré généralement par une tension de ≈100eV. L’échantillon est alors ionisé et les ions positifs qui en résultent sont attirés vers une cathode annulaire, la traversent et vont ensuite subir une sélection par leur masse.In the chemical ionisation technique, the gaseous sample is ionised by collision with positively charged ions. Dans la technique d’ionisation chimique, l’échantillon est ionisé par collision avec des ions chargés positivement. Ces ions sont produits par bombardement d’électrons dans un excès de gaz réactif, souvent du méthane (CH4).In general, chemical ionisation produces less fragmentation of molecules than electron impact ionisation. En règle générale, l’ionisation chimique produit moins de fragmentations des molécules que l’ionisation par impact électronique.
La séparation par masse est effectuée grâce à un champ électrostatique et/ou magnétique. Les particules chargées suivent des chemins différents en fonction de leurs ratios de masse sur charge lors du déplacement à travers un espace soumis à un champ électrostatique et/ou magnétique.
Pour les ions de même charge, avec des valeurs fixes de tension d’accélération V et de champ magnétique B, la trajectoire de l’ion est régie uniquement par sa masse (équations en annexe).
Un autre type d’analyseur de masse est le quadripôle. Un quadripôle est constitué de quatre tiges métalliques parallèles, reliés électriquement deux à deux en opposées. Les tiges, en plus de leur potentiel fixe (DC), ont une tension avec une fréquence alternative (RF) qui leur est appliquée. En faisant varier ces champs électriques, seuls les ions d’un m/z particulier passent par le quadripôle, et tous les autres ions seront déviés dans les tiges et perdus. Le spectre de masse est scanné en faisant varier le potentiel fixe et en faisant osciller les voltages. La fréquence RF est généralement fixée à environ 1-2MHz. Comme c’est un dispositif purement électrostatique, le spectre de masse peut être balayé très rapidement, typiquement de 0 à 800 unités de masse en une fraction de seconde.
Les ions sont ensuite comptés par un détecteur. Les ions heurtent le détecteur et le courant en résultant passe par une grande résistance, où la tension est mesurée. L’intensité du courant circulant est directement proportionnelle au nombre d’ions reçu au niveau du détecteur.
Une alternative de détection est de surveiller le temps de vol (TOF) d’un ion quand il passe par le détecteur. Les ions sont générés dans une zone source de l’instrument, et un potentiel est appliqué sur la source pour en extraire les ions et les accélérer dans le détecteur, qui se compose d’une zone de dérive sans champ appliqué. Le temps de vol des ions à travers la zone de dérive ne dépendra que de leur masse. Pour obtenir un spectre de masse à partir de mesures fiables de temps de vol, le temps d’extraction des ions doit être connu. Ainsi, les détecteurs de ToF peuvent faire office d’analyseurs de masse et de détecteur.
Après la détection, les données sont combinées par un logiciel et donnent un spectre avec des pics dont la valeur en abscisses correspond aux masses des fragments de la molécule ou de l’ion et l’intensité au nombre de molécules ou d’ions comptés.
Comme il peut y avoir confusion entre les différentes composantes si l’on utilise uniquement la chromatographie gazeuse, il est possible de la combiner avec un spectromètre de masse qui analyse les composés quand ils sortent de la colonne. La fin de la colonne de la chromatographie en phase gazeuse est directement insérée dans la source d’ions du spectromètre de masse. L’échantillon gazeux est bombardé par des électrons avec une énergie autour de 70eV, dans le cas d’un impact électronique. Les ions sont ensuite séparés par un quadripôle ou un champ magnétique. Les quadripôles sont les plus fréquents en raison de leur balayage rapide du spectre de masse.
Les données résultant de cette analyse sont représentées par un chromatogramme avec pour chaque pic, un spectre de masse du composé sorti à ce moment-là. Il est ainsi possible de vérifier la composition de l’échantillon et de connaître sa nature.
Contributeur: A. Bonneau